Real-Time PCR是一种实时检测PCR扩增过程的技术。在PCR反应过程中，通过连续监测荧光信号来实时了解反应进程，从而实现对核酸的定量分析。这种方法具有高度的灵敏性和特异性。区别解释：RT-PCR主要关注RNA的扩增，通过反转录将RNA转化为DNA后进行PCR扩增，常用于基因表达研究。
real-time PCR：实时PCR（real-time PCR）属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。Real-timePCR与reverse transcription PCR相结合，能用微量的RNA来找出特定时间细胞组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为定量RT-PCR（QRT-PCR）。
PCR是一种高效复制DNA的技术，通过变性、退火和延伸三个步骤进行。RT-PCR是PCR的特殊应用，它首先通过逆转录将RNA转化为cDNA，再用cDNA作为模板进行PCR扩增。而QRT-PCR是在RT-PCR的基础上，额外加入了内参基因的引物，用于同时检测目的基因和内参基因，但其结果是基于PCR扩增后的终产物，而非原始模板量。
QRT-PCR是RT-PCR的一种变体，它引入了内参基因的引物，使得目标基因和内参基因同时被扩增。然而，QRT-PCR的结果是基于PCR终产物的分析，无法精确测量未经过PCR放大的原始模板量。Real-time PCR（或称实时定量PCR，Q-PCR）是PCR的一种定量分析方法，它以DNA的实时增幅为依据。
你说的应该是real time pcr吧，注意rt其实是逆转录reverse transcription的缩写，和real time一定要分开来。
在做QRT-PCR时，一定要有内参，即在PCR时，每个标本都要做对应的内参，而且每次都是看家基因，一般用bate-actin，有时也用GAPDH。内参的选择：普通PCR内参的大小没有多大要求，但real time一般选择300bp以下。
有时候溶解曲线看上去是很特异的，而电泳却能跑出两条带；加内参是为了做表达比对，跟内参比，这样才能知道是高表达还是地表达，也可以作为判断PCR反应过程是否顺利的依据。
RT-PCR：反转录PCR（reverse transcription-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA（cDNA），再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。QRT-PCR在RT-PCR体系中同时加入内参标基因的引物，使目的基因和内参基因在同一条件下同时扩增。
内参的选择和使用是为了精确定量目标RNA。常见的内参如G3PD和β-Actin等，它们的作用在于校正RNA定量误差、加样偏差以及可能存在的PCR反应体系扩增效率不一致等影响。在实验设计时，应确保内参的稳定性和准确性。PCR过程中，避免平台效应的出现非常重要。
理解qPCR与普通PCR引物设计和操作的区别是深入掌握分子生物学技术的关键。首先，qPCR，即实时荧光定量PCR，与普通PCR相比，在实时监控PCR反应过程中引入了荧光标记，以便在每一轮循环后收集数据，从而实现对起始模板数量的精确分析。
总的来说，qPCR引物设计是一个精细且科学的过程，它要求精确的序列匹配，高效的扩增效率，以及无可争议的特异性。每一个步骤都至关重要，只有精心策划，才能在分子世界中精确地捕捉到目标信息。尝试并掌握这一流程，将带你进入精准生物学的前沿领域。
qPCR是指实时荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction），是一种分子生物学技术。其基本原理是引物与靶标结合，产生荧光信号，再通过荧光信号的强度来测定被检测靶标数量的多少。相对于传统的PCR技术，qPCR具有更高的灵敏度、特异性和准确性，可以广泛应用于基础研究、医学诊断、农业种植等领域。
荧光定量PCR（qPCR）的引物设计至关重要，它直接关系到实验的准确性和效率。设计时需考虑的关键因素包括特异性、扩增效率和产物长度。以下是几个关键步骤：首先，引物设计需跨越内含子，确保扩增产物只来自cDNA，消除gDNA污染可能带来的干扰。
1、由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引 物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因 的表达丰度进行调整。
2、扩增过程：使用qPCR仪对PCR反应进行数轮扩增，扩增曲线中根据扩增产物的拷贝数与相关基因的相对丰度呈正比关系，多次扩增后产生的曲线在最后一个扩增周期称为CT值。
3、即， 不管如何，这些统计量所描述出来的转录本丰度应该得是其真实丰度（r_g）的m倍（ m必须是一个根据模型定出的不变值），均值也将是r_mean的m倍，只有这样才是得出有意义的结果。
4、通常是3－15个循环的荧光信号 同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线 阈值（threshold）自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
5、ChIP-qPCR是对分离和纯化后的染色质免疫沉淀的DNA进行定量PCR分析，检测特定区域蛋白质结合的丰度。这能揭示转录因子、组蛋白修饰等对基因表达的调节效果。ChIP-Seq技术则是结合第二代测序技术，能高效地在全基因组水平上检测与组蛋白、转录因子等相互作用的DNA片段，提供更全面的基因调控信息。
6、比如，可以 利用转录抑制剂放线菌素D抑制细胞内基因转录后 ，在不同时间点收集总RNA，然后做 Northern或者RT-PCR ，比较不同时间点mRNA丰度的变化。如下图，Boxuan Simen Zhao.在“Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications”一文中通过半衰期讲述m6A修饰对mRNA稳定性的影响。
