1、荧光定量PCR与FPKM值都是用于衡量基因表达量的工具，但它们的原理和应用范围有所不同。FPKM值是基于RNA-Seq技术测量整个生物体特定组织中的所有基因表达量。它被视为一个全面的基因表达量指标，涵盖了生物体中几乎所有能表达的基因。
2、深入解析：荧光定量PCR与FPKM值的差异与联系荧光定量PCR（qPCR）和FPKM值，作为基因表达量测量的两种重要工具，它们在揭示基因表达水平时各有独特的原理和应用场景。首先，让我们来看看FPKM的内涵。
3、然而，金无足赤，作为老戏骨的FPKM有一个明显的缺点是不同样本/批次数据的归一化数值总和不一致，那么在进行下游分析时就会出现问题。小鲜肉儿，TPM（Transcripts Per Million）正是为了解决该问题而生。
1、从TCGA官方网站下载数据，使用R语言进行清洗处理。 直接使用R语言下载数据，但考虑到网络不稳定的问题，这种方法我并未使用。 利用其他数据库（如cBioprotal、UCSC）中整理好的数据，我偏好从cBioprotal下载，因为它包含了TCGA官网的其他数据集，有助于整合数据，扩大样本量。
2、需要的数据：TCGA上的临床数据。当你下下来时会发现有一大堆。这时需要你做的就是筛选你所需要的。你需要的有：目的基因的表达量、患者生存时间、患者生存/死亡状态。这里的目的基因可以是你前期差异基因分析/通路分析/临床分析等所得到的一个或几个基因，你需要在下一步生存分析中进一步验证其预后影响。
3、TCGA转录组数据打包，一次下载即可获取counts、TPM、FPKM三种类型的数据，无需单独下载。 数据采用最新注释，Gene symbol已标注，无需额外注释。 转录组数据自带RNA类型，方便区分编码RNA和非编码RNA。关于数据下载，推荐使用TCGAbiolinks包，方便且节省时间。接下来进行代码演示。代码演示部分省略。
4、利用TCGA肺腺癌和肺鳞癌数据，通过gsva函数将基因表达矩阵转换为基因集分数矩阵，识别差异通路。在ssGSEA中，针对单个样本的GSEA分析，基因列表排序和ES计算基于样本表达值，不依赖基因与表型的相关度。利用gsva函数指定method=ssgsea进行ssGSEA，可进行差异分析、热图绘制等。
5、首先，打开GDC提供的下载文件，如“gdc_download_xxxxx”，里面包含了多份单独的文件夹，每个文件夹内有一个tsv格式的基因表达文件，对应一个样本的基因表达量数据。由于没有样本名信息，你需要在下载数据时一并获取metadata或sample_sheet文件，以建立样本名与文件名之间的对应关系。
1、假设有2个样本，6个基因：可以发现每个基因在样本2中的表达量都是样本1中的2倍。这个很可能不是由于样本本身的生物学因素引起的，而是由于测序的深度等影响的。需要对样本基因的表达量进行校正。
2、以第一行基因的ratio为例，写出具体计算过程：由于大部分基因不会发生差异表达，所以样本内的ratios应是相当的。
3、不难发现结果都和原来的708有差异。但是好像将两者进行平均后，结果就是708。结果验证了我的猜想。
4、if （！requireNamespace（BiocManager， quietly = TRUE）install.packages（BiocManager）BiocManager：install（DESeq2）library（DESeq2）准备数据 featureCounts定量后的数据，或者FPKM数据（下一遍讲如何获取FPKM）定量后的数据的数据格式如下：colData，其实就是表型数据。
5、并且WGCNA采取软阈值的方式来挑选genes更加合理。既然挑选差异表达基因，还是采取log2FC和padj来进行。
6、数据准备阶段，我们需要原始计数数据（Counts）而非归一化后的数据，如 FPKM 或 TPM。TCGA 数据可以从 UCSC Xena 下载，具体步骤参考之前的文章。BRCA 乳腺癌数据为例，样本命名中第 115 位代表样本类型，01 和 11 分别表示肿瘤和正常组织样本。
为了筛选差异基因，我们将使用Deseq2进行转录组分析。首先，确保你已经安装了RStudio，这是执行分析的必要环境。接下来，准备两个关键文件：基因表达量count数据以及样本信息文件。表达量数据应为每一行为一个基因，每一列为一个样本，而样本信息应包含样本名称与对应处理或类型。
启动R，导入R包以及数据。 验证基因表达量和样本信息是否匹配，匹配证明数据无误。 执行差异分析。得到的diff结果为总分析结果，导出保存。筛选差异基因，依据Padj值（矫正后P值）小于等于0.05（显著差异）和log2FC（表达量差异倍数）大于1或小于-1的标准。
核心的差异分析部分，DESeq会输出差异文件，通过P值和LogFC筛选出显著的差异基因。上调和下调的筛选细节，可以参考之前的推文。1章节中，为了便于可视化，通常会对Count值进行标准化，这里使用vst函数进行处理，然后绘制差异基因热图。
1、从RNA提取到qPCR数据的有效性分析及常见问题处理 要确保qPCR结果的可靠性，需综合考虑多种因素。首先，扩增曲线应呈现平滑的S型，起始无扩增，峰时间正常。Ct值在临床检测中小于33，科学研究中小于38，内参基因一般小于20，并且样品间内参Ct值差不超过1，以保证内参基因表达稳定。
2、在同学（zi）的（ji）强（xian）烈（de）要（mei）求（shi）下，我的qPCR数据处理小程序迎来了V0版本，主要增加了自动添加误差线的功能。
3、上面显示p value summary为三颗星，即代表该数据具有统计学意义，并且为三颗星。返回属性图数据。即点击左边的Graphs下面的Data 1，点击最上面的Draw下面横线，选择横线，点击Write下面的黑体字T，在横线上面标记星号或者ns即可。该例子里的统计学分析为3颗星。完美的QPCR数据分析图就做出来啦。
4、细胞数量测定通常是以验证过的参考基因来均一化的。这种策略在单细胞分析中应避免，因为单个细胞中的所有转录本水平随时间变化。我们发现，校正分析和无监督算法（如Kohonen self-organizing maps）对定义亚群和基因网络很有用。Finn-Arne Weltzien（挪威兽医学院）我们在利用单细胞qPCR进行定量测定时很小心。
5、那么进入正题吧！今天我们讲讲假设检验这个东西，并且会以 qPCR数据处理 为例子，应用假设检验，获得传说中小于0.05就很了不起就P值。
6、荧光定量PCR（qPCR）就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，荧光定量PCR（ qPCR）由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。
1、我们有时候会有一个需求，就是从我们表达量矩阵里面挑一个单基因，来展现该基因在 两种或者多种不同处理下 的 时序性表达 。就像下面的图那样。首先让我们构建下测试数据 我这里只构建了一个Control下0，2，4，6，14h以及0，2，4，6，8，10，12，14h下的 一个基因 的表达矩阵。
2、GSEA常用于高分文章中的图展示。图通常分为两部分，第一部分为基因Enrichment Score的折线图，横轴为基因，纵轴为ES值。峰值即为基因集的Enrichemnt score，峰值前的基因是该基因集下的核心基因。第二部分为hit标记，显示位于该基因集下的基因。
3、方法如下：图标分析 将数据进行可视化处理，简单的说就是绘制图表。单纯从数据的角度很难发现其中的趋势和联系，而将数据点绘制成图表后趋势和联系就会变的清晰起来。对于有明显时间维度的数据，我们选择使用折线图。协方差及协方差矩阵分析 第二种相关分析方法是计算协方差。
4、首先『11个点横坐标从100开始，分别是100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210』其实那是12个点。
5、第一：统计图总体而言就是将数据整合起来，用一种较为直观的方式将统计整理后的数据呈现出来，给人以鲜明地印象。而不同类型的统计图也各有其特点，它们所运用和侧重的地方也有所不同。
6、Python画图代码能以直观的方式展示数据，是数据科学和可视化中的重要工具。以下是常见的Python画图代码示例：直方图是一种柱状图，用于表示数据分布。通过将数据分组并计算每组的频率，可以生成直方图。使用matplotlib库，可以轻松绘制直方图。
